FAM-VAD是可透过绿色荧光细胞的多胱天蛋白酶抑制剂，可靶向1、2、3、6、8、9或10个胱天蛋白酶。一旦进入细胞内，该抑制剂就会与活性胱天蛋白酶共价结合，从而产生绿色荧光。当添加到细胞群中时，FAM-VAD-FMK探针进入每个细胞，并与存在于活性胱天蛋白酶异二聚体大亚基上的反应性半guangansuan残基共价结合，从而抑制了进一步的酶促活性。结合的标记试剂保留在细胞内，而任何未结合的试剂将扩散出细胞并被洗去。绿色荧光信号是添加试剂时细胞中存在的活性胱天蛋白酶数量的直接量度。包含结合了标记试剂的细胞可以通过基于96孔板的荧光法，荧光显微镜，或流式细胞仪。它可在人类，啮齿动物和果蝇等多种细胞系中起作用。

协议范例

乍看上去

重要笔记

重要的是要存放在<-15°C的环境中，并应存放在阴凉处。

自收到之日起12个月内可以使用。

程序

以下协议仅提供指导，应根据您的特定需求进行修改。

使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的常规解决方案胱天蛋白酶测定

1. 在DMSO中准备10 mM的储备溶液。
   

2. 如下准备2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。
   

3. 将等体积的半胱天冬酶标准品或样品与2X半胱天冬酶底物测定溶液混合，并在室温下孵育至少1小时。
   

4. 使用荧光酶标仪读取荧光，或使用酶标仪读取吸光度。

使用细胞渗透性FMK Caspase探针的细胞Caspase测定

1. 在DMSO中准备2-5 mM的储备溶液。
   

2. 根据需要处理细胞。
   

3. 通过用20 mM Hepes缓冲液（HHBS）在Hanks中稀释DMSO储备溶液（来自步骤2.1），制备2X渗透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。
   

4. 将等体积的处理过的细胞与2X半胱天冬酶底物测定溶液混合（来自步骤2.3），并在37°C，5％CO _2的  培养箱中孵育细胞至少1小时。
   

5. 用HHBS清洗细胞至少一次。
   

6. 通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪监测荧光强度。

使用细胞渗透性FMK Caspase探针进行细胞半胱天冬酶测定 （仅适用于＃13470-13476）

1. 通过向小瓶中加入50 µL DMSO制备250X储备液。
   

2. 根据需要处理细胞。
   

3. 以1：250的比例将250 X DMSO储备溶液添加到细胞溶液中（例如2 µL至500 µL细胞），并将细胞在37°C，5％CO2的培养箱中孵育1小时。
   

4. 用HHBS清洗细胞至少一次。
   

5. 通过流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪监测荧光强度。