摄取脂肪酸是治疗许多人类疾病（例如肥胖症，2型糖尿病和肝脂肪变性）的重要治疗目标。Screen Quest™荧光脂肪酸摄取测定试剂盒为测量含有脂肪酸转运蛋白的细胞中的脂肪酸摄取提供了一种简单而灵敏的方法。该套件使用专有的十二酸荧光脂肪酸底物。可以在具有底部读取模式或FITC通道的任何荧光酶标仪上进行此脂肪酸摄取测定试剂盒。该测定可以在96孔或384孔微量滴定板中以简单的混合和读取程序进行，并且很容易适用于高通量筛选应用。

平台

组件

协议范例

乍看上去

协议摘要

1. 平板细胞在生长培养基中4-6小时

2. 将细胞转移至无血清培养基中1小时，然后根据需要处理细胞

3. 添加100 µL /孔的脂肪酸上染溶液

4. 立即监测动力学在Ex / Em = 485/515 nm时的荧光增强，或在孵育60分钟后监测终点读数（底部读数模式）

重要说明
开始实验之前，请在室温下解冻所有试剂盒组件。

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，制备后应储存在-20°C下。避免重复冻融循环。

TF2-C12脂肪酸储备溶液：
将20 µL DMSO（组分C）添加到TF2-C12脂肪酸（组分A）小瓶中，并充分混合。注意：20 µL的荧光脂肪酸底物储备液足以装一板。如果将试管紧密密封并避光，则可以将未使用的荧光脂肪酸底物原液分装并在< -20 ^o C下保存两个月。避免重复冻融循环。

准备工作溶液

加载脂肪酸染料的溶液：
将20 µL TF2-C12脂肪酸储备溶液添加到10 mL的测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。注意：  10毫升脂肪酸染料上样溶液足以装满一盘；为每个盘子准备新鲜的食物并进行实验。

程序

细胞制备：

根据需要准备细胞。以下方案是制备3T3-L1脂肪细胞的指南。

• 准备分化的3T3-L1脂肪细胞（参见参考文献1）：3T3-L1成纤维细胞在DMEM / FBS汇合后在75 cm烧瓶中培养2天，然后在补充有0.83 µM胰岛素，0.25 µM的DMEM / FBS中培养2天。disaimisong和0.25 mM异丁基甲基huangpiaoling。更换培养基以维持disaimisong和IBMX不在另外2天的胰岛素浓度。然后将培养基更换为单独的DMEM / FBS，持续3-5天。在分化诱导后的第8至12天使用分化的细胞（其中至少95％通过脂质液滴的积累显示出脂肪细胞表型）。
  

• 在生长培养基中以50,000-80,000个细胞/孔/ 100 µL / 96孔或12,500-20,000个细胞/孔/ 25 µL / 384孔黑墙/透明底部细胞培养板接种3T3-L1脂肪细胞，用Poly-D赖氨酸板固定4个实验前-6小时。断开制动器，以800 rpm的速度离心板2分钟。 注意：建议将3个仅含生长培养基的孔（无细胞）平板作为空白孔进行数据归一化。 注意：我们发现在同一天（4-6小时，然后血清被剥夺1小时）接种的脂肪细胞比接种过夜的脂肪细胞效果更好。

• 从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，并用90 µL /孔/ 96孔板或20 µL /孔/ 384孔板的无血清培养基剥夺细胞。将细胞在37ºC，5％CO ₂培养箱中孵育1小时。
  

• 通过添加10 µL /孔/ 96孔板（5 µL /孔/ 384孔板）或1X Hanks和20 mM Hepes缓冲液（1X HBSS，pH 7.4）或您选择的缓冲液来处理细胞复合稀释剂。对于空白孔，添加化合物稀释剂。将细胞在37℃，5％CO ₂培养箱中孵育所需的时间（对于用胰岛素处理的3T3-L1细胞，则需要30分钟）。

样本协议：

1. 根据需要用测试化合物处理细胞。
   

2. 从培养箱中取出经过化合物处理的细胞板，添加100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）（包括空白孔）的脂肪酸染料上载溶液。
   

3. 使用底部读取模式，使用荧光酶标仪在Ex / Em = 485/515 nm（在495 nm处截止）下测量荧光信号。注意：对于动态读数：以20秒的间隔立即读取荧光强度，持续30-60分钟。注意：对于终点读数：在30-60分钟孵育结束时读取荧光强度。