Cell Meter™检测试剂盒是一套用于监测细胞活力和增殖的工具。有多种参数可用于监测细胞活力和增殖。在正常细胞中，DNA密度根据细胞是生长，分裂，静止还是执行其正常功能而变化。细胞周期的进程受各种细胞周期调节因子之间复杂的相互作用控制。这些调节剂激活转录因子，该转录因子与DNA结合并开启或关闭导致细胞分裂的蛋白质的产生。在这种调节级联反应中的任何失误都会导致细胞异常增殖，这是许多病理状况（例如肿瘤形成）的基础。活细胞研究的潜在应用是确定细胞DNA含量和细胞周期分布，以检测生长模式的变化，监测细胞凋亡以及评估肿瘤细胞的行为和抑制基因的机制。该特定试剂盒旨在使用Nuclear Red™CCS1（固定细胞中的细胞周期染色剂）监测细胞周期进程和增殖。染料穿过透化的膜并插入细胞DNA中。试剂盒中提供的RNase降解RNA后，Nuclear Red™CCS1的信号强度与DNA含量成正比。可以使用流式细胞仪（FL2通道）监测给定样品中处于G0 / G1，S和G2 / M期的细胞百分比，以及处于凋亡之前的亚G1期的细胞百分比。

1. 用5×10 ⁵到1×10 ⁶细胞/ mL 的密度制备含测试化合物的细胞

2. 用70％乙醇固定细胞

3. 将0.5 µL 100X Nuclear Red™CCS1和5 µL RNase A加入0.5 mL细胞溶液中

4. 在室温下孵育30-60分钟

5. 使用带有FL2通道的流式细胞仪分析细胞

重要说明
开始实验前，请在室温下解冻所有组分。

程序

1. 用测试化合物处理细胞所需的时间，以诱导凋亡或其他细胞周期功能。
   

2. 对于每个样品，以0.5×10 ⁵至1×10 ⁶细胞/ mL 的密度在0.5 mL PBS中制备细胞。
   
   对于贴壁细胞：将细胞用yidanbaimei消化，悬浮在10％FBS培养基中，离心（1000 rpm，5分钟），然后将沉淀重悬于PBS中。
   
   对于悬浮细胞：将细胞离心（1000 rpm，5分钟），并将沉淀物悬浮在PBS（1 mL）中。 注意：应单独评估每种细胞系，以确定诱导凋亡的*细胞密度。

用70％乙醇固定细胞：

1. 将0.5 mL细胞悬液吸移至1.2 mL无水乙醇中（ZUI终浓度约为70％）。

2. 在冰上孵育细胞至少2小时（或在-20°C过夜）。在染色之前，细胞可以在-20°C下保存2年。注意：在细胞表面抗原被单克隆抗体染色后，通常将乙醇用于固定，而在细胞内抗原被单克隆抗体染色后，通常将甲醇用于固定。在此过程中，将固定并分析整个单元格。由于仍然存在整个细胞团，因此通常包括使用RNase消除任何双链RNA。尽管已经对整个细胞进行了分析，但尝试检测与DNA结合的某些细胞内抗原的尝试可能会失败，因为蛋白质会从透化的细胞中漏出（例如绿色荧光蛋白）。在这些情况下，在酒精固定之前，用PBS中的1％多聚甲醛进行短暂的预固定（在4-6°C下10分钟），将有助于将蛋白质保留在细胞中。

用Nuclear Red™CCS1染色细胞：

1. 以1000 rpm的速度沉淀细胞5分钟，并用冷PBS至少洗涤一次。
   

2. 将沉淀物悬浮在0.5 mL测定缓冲液（组分C）中。
   

3. 加入5 µL 100X Nuclear Red™CCS1（组分A）和5 µL 100X RNase A（组分B）。
   

4. 在室温下孵育细胞30至60分钟。注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
   

5. 可选：将细胞以1000 rpm离心5分钟，然后将细胞重悬于0.5 mL检测缓冲液（组分B）或您选择的缓冲液中。
   

6. 使用FL2通道（Ex / Em = 490/620 nm），通过流式细胞仪监测荧光强度。在目标细胞上门，不包括碎片。

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