22121Single Cell Sequence Specific Amplification Kit 生化
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生产厂家厂商性质
南京市所在地
AZ 3146 (AZ-3146)
¥1986RNase Inhibitor(40U/ul)
¥280茉莉酸甲酯
¥1980Mithramycin A (Plicamycin) 光辉霉素A
¥680liangxingmeisuB Amphotericin B
¥3690Tetracyclin HCl 四环素盐酸盐(USP)
¥225Spectinomycin Hydrochloride
¥2000衣霉素 Tunicamycin
¥1780Phleomycin(20mg/ml)腐草霉素20 mg/ml
¥921Bialaphos 双丙氨膦
¥1800Plant Preservative Mixture (PPM)
¥480Aureobasidin A(AbA)金担子素A
¥1378Single Cell Squence Specific Amplification Kit是基于一步RT-PCR的预扩增方法,适用于单细胞或者微量总RNA中转录组的扩增,便于进行单细胞转录组表达差异的分析。本试剂盒实现了RNA提取纯化、逆转录和PCR预扩增反应在同一管内完成,不需要额外的操作,简单高效,还能减少实验误差和污染风险。除了应用于单细胞,本试剂盒亦可适用于2~1,000个细胞的一步扩增,应用时仅需按照细胞数目减少一步扩增的循环数;获得的扩增产物适合于任何实时荧光定量PCR分析法。染料法和探针法qPCR分别推荐ToloBio通用型2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal, #22204)和2 × Q3 probe qPCR Master Mix (Universal, #22205)。
产品优势
✽ 一步法RT-PCR预扩增:细胞裂解、RNA逆转录和PCR扩增在同一管内完成,不需要额外的移管操作。
✽ 一次可扩增500个靶基因:扩增产物适合用任何实时荧光定量PCR仪分析。
实验案例
分别使用ToloBio #22121与竞品Supplier A、Supplier B,对不同浓度的小鼠巨噬细胞进行一步法RT-PCR预扩增,产物进一步qRCR(ToloBio #22204)扩增,比较在相同引物和相同细胞个数条件下的扩增情况,包括扩增灵敏度、扩增线性和扩增平台。结果显示,ToloBio #22121在不同浓度细胞(1~1000个细胞/test)条件下扩增性能稳定、优异。
实验流程
1.Primer Pool的制备
将不同待测基因的扩增引物进行混合,制备成Primer Pool,使各引物的终浓度为0.1 μM。以Bcl-2基因为例,其上、下游引物原浓度均为100 μM,则应各取1 μL加入998 μL RNase-free ddH2O至终体积为1 mL。多个基因引物对的制备依此类推,最多可混合500对不同基因的扩增引物。
2.预扩增反应体系
在RNase-free离心管中冰上配制如下反应体系:
组分 | 体积 |
2 ×Tolo scAmp Reaction Buffer | 2.5 μL |
Primer Pool (0.1 μM) | 0.5 μL |
RT/Taq Enzyme Mix | 0.2 μL |
Cell sample a | 0.5~1 μL |
RNase-free ddH2O | Up to 5 μL |
a.细胞可储存于PBS缓冲液中。
以上体系(除细胞样本外)充分混匀后冰上放置备用,可加入1~1000个细胞样本。为了使细胞充分破碎,将加入细胞样本的完整体系置于-80℃冰箱2 min,随后3,000 rpm (1,000 × g)室温或4℃离心2 min,然后立即放入PCR仪进行如下反应:
程序 | 温度 | 时间 | 循环数 |
反转录 | 50℃ | 60 min | 1 cycle |
预变性 | 95℃ | 3 min | 1 cycle |
循环反应 b
| 95℃ | 15 sec | 20 cycles
|
60℃ | 15 min | ||
Hold | 4℃ | - | - |
b.建议循环数随起始细胞数量作相应调整:1个细胞20个循环,10个细胞17个循环,100个细胞14个循环,1,000个细胞11个循环。
反应结束后,每管加入20 μL RNase-free ddH2O (1:5稀释),用移液器吹打混匀,室温短离集于管底。可立即进行后续qPCR定量反应或-20℃短期保存。
3.qPCR反应体系
冰上配制如下反应体系:
组分 | 体积 |
2 × Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal,#22204) | 10 μL |
Primer F (10 μM) | 0.5 μL |
Primer R (10 μM) | 0.5 μL |
Template DNA c | 1 μL |
ddH2O | Up to 20 μL |
c.为减少加样误差,建议将1:5稀释的预扩增产物再稀释10倍后使用。
以上体系充分混匀后,短暂离心集于管底,随后立即放入qPCR仪进行如下反应:
Stage | 程序 | 温度 | 时间 | 循环数 |
Stage 1 | 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 cycle |
Stage 2
| 循环反应
| 95℃ | 10 sec |
40 cycles
|
60℃ | 30 sec | |||
Stage 3 | 熔解曲线 | 仪器默认程序 | 1 cycle |
产品组成
组分 | 22121 (200 rxns) |
● 2 × Tolo scAmp Reaction Buffer d | 500 μL |
● RT/Taq Enzyme Mix e | 40 μL |
○ RNase-free ddH2O | 2 × 1 mL |
d.包含 dNTP;
e.包含RTase、RNase inhibitor和Taq DNA polymerase;
-20℃保存,≤ 0℃运输;