rTEV蛋白酶

rTEV 蛋白酶（重组型）是经过基因工程改造后的重组蛋白酶，该酶特异性识别 Glu-Asn- Leu-Tyr -Phe-Gln-Gly七氨基酸序列，并高特异性、高活性剪切(剪切位点在Gln-Gly之间)。该酶经 6×His 标签纯化而得(含组氨标签)，纯度达99％，剪切反应完毕后可通过 Ni-NTA Resin )去除。该酶在 4℃-30℃温度、pH 范围（6.0-8.5）反应条件下均具有活性（见下表）。

活性定义：在 1×rTEV Buffer（50 mM，pH8.0, 0.5 mM EDTA,1mM DTT），30℃反应 1h，剪切>85％的 3 μg 底物所需要的酶量定义为一个活性单位。
应用：融合蛋白标签剪切去除。
储存：长期储存-70℃，可储存 2 年，-20℃可储存 6 个月。
操作方法
1. 在 EP 管中配制如下反应体系
融合蛋白 20 μg
20×rTEV Buffer 7.5 μl
0.1M DTT 1.5 μl
rTEV Protease 1-3 μl
ddH20 Up to 150 μl
2. 30℃孵育，在 1、2、4、6 小时分别吸出 30 μl 上述反应液，置于单独的 EP 管中。
3. 向上述 EP 管中加入 30 μl 2×SDS Loading Buffer，置于-20℃。
4. 样品全部反应完毕后，样品煮沸 5 min，取 40 μl 进行SDS-PAGE 分析。
5. 如融合蛋白要求低温处理，可将反应液置于 4℃，请延长反应时间，并增加 rTEV 酶用量。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。