TRzol LS（液体样本 RNA 提取试剂）

储存条件：
TRzol LS 在室温下能稳定保存 12 个月。尽管如此，为达到效果，我们建议保存在 2-8°C 的环境下。
重要提示：
有毒物接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适，看医生并寻求和其他成分的正确治疗方案。
产品介绍：

TRzol LS试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层、中间层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来回收。无论是人、动物、植物还是细菌，该方法对少量及大量的组织和细胞均有较好的分离效果。TRzol LS 试剂操作上的简单性允许同时处理多个样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRzol 抽提的总 RNA 能够避免DNA 和蛋白的污染，可用于 RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+筛选、体外翻译、RNA 酶保护分析和分子克隆。如果是用于 PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用扩增级的DNase I 来处理抽提的总RNA。

注意事项：
1.从少量的组织(1~10mg)或细胞(10 2-10 4 个)中分离RNA 样品：往组织或细胞中加 入 800µl TRzol。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉 淀 RNA 之前，加入 5~10μg 无 RNA 酶的glycogen 作为水样层的载体。为降低其黏度 在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen 会留在水样层中 并和 RNA 共析出。在浓缩到 4mg/ml 之前它不会抑制逆转录反应链的合成也不会 抑制 PCR。

2.在匀浆化后和加入氯仿之前，样品可以在-60℃或者-70℃保存至少一个月。将 RNA 沉淀溶于 75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周，在-5—-20℃下至少可保存一年。

3.用 TRzol LS 抽提 RNA 时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通 风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，室温保持在 15~30℃的条件下。

自备试剂：

氯仿 、 异丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water（将水加入 无 RNA 酶的玻璃瓶中，加入 DEPC 至 0.1% (V/V)。放置过夜并高压灭菌）。0.5% SDS 溶液(RNase-Free water 配制)（可选）。

操作步骤：

1.样品预处理 a.生物液体 每0.25ml液体样品(血清，血浆等等)加入0.75ml TRzol LS，用加样枪吹打液体样品 几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×10 6个细胞至少加入0.75ml TRzol LS。对于含有高 污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。TRzol LS 和液体样品的终体积比总是3：1。 b.组织 用glass或强力匀浆器搅匀组织样品，每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml，如果组织样品的体积小 于0.25ml，加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3：1。 c.单层生长的细胞 直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解细胞，用加样枪吹打 帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRzol LS 量 （每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因为培养板中附着残留的培养液 已经充分稀释了TRzol LS 。 d.悬浮生长的细胞 通过离心来沉淀细胞。在TRzol LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每 5~10×10 6的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×10 7细菌加0.75ml的TRzol LS。和步骤 b 一样用灭菌水调节样品体积到0.25ml。在加入TRzol LS前应避免洗涤细胞，因为那 样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。 2.分离阶段 将匀浆样品在15-30°C条件下孵育5min以使核蛋白体分解。每0.75ml TRzol LS 加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~15 min。 在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15 min。离心后混合物分成三层： 下层-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。 水样层的容量大约为所加TRzol LS 容量的70%。

2.RNA 的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层和中间层同 样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS对应0.5ml 异丙醇。将混合的样品在15-30°C条件下孵育10min并在2~8°C下以不超过12,000×g的离 心力高速冷冻离心10 min。RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后会形成一胶状片状 沉淀附着于试管壁和管底。

3.RNA 的漂洗 移去上层悬液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗涤RNA沉淀一次，每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2~8°C下以不超过7,500×g的 离心力高速冷冻离心5 min。

4.RNA 的再溶解 室温简单干燥 RNA 沉淀，不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要的是，不能让 RNA 沉淀干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其 OD260 /OD280 比值<1.6 。用移液管分几次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water 配制)来溶解RNA（如果RNA 以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。） RNA 还能被 甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在-70°C。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。