T5核酸外切酶

产T5 核酸外切酶沿 5’-3’方向降解 DNA，它可降解双链DNA、单链 DNA 和缺刻的质粒 DNA。它既能从 5’-末端起始降解 DNA，也能从线性或环状双链 DNA 的切刻或缺口处起始降解 DNA，但不能降解超螺旋双链 DNA。基于以上特性，T5 核酸外切酶可应用于 Gibson 组装。
储存：-20℃可保存 3 年。
活性定义：1 单位指在 50 μl 反应体系，37°C 条件下，30分钟内能从双链 DNA 底物上催化产生 1 nmol 的酸可溶性脱氧核糖核苷酸所需要的酶量。
使用注意事项：
（1）1×T5 Exo Buffer：50mM KAc，20mM Tris-Ac pH 7.9，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT。该酶在 PCR Buffer 中也具有活性。
（2）该酶的反应温度为 37°C，在 50°C 也具有一定活性，因此可用于 Gibson 组装。
使用方法：
1.建立如下反应体系
模板 DNA 1 μg
10×T5 Exo Buffer 5 μl
T5 Exonuclease (10 U/μl) 1 μl
ddH2O upto 50 μl
2. 37°C，30min。
3. 加入 EDTA 至总浓度为 11mM，终止反应。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。