BCA Protein Assay Kit

描述：BCA 蛋白质定量试剂盒是根 据目前世界上常用的蛋白浓度检测方法之一－BCA （bicinchoninic acid）法改良研制而成，该试剂盒具有蛋白 浓度测定的简单性，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。本试 剂盒的原理是蛋白质分子中的肽键结构在碱性环境下能与 Cu2+络合生成络合物，将 Cu2+还原成 Cu+，而 BCA 试剂可 敏感特异地与 Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，并在 562nm 处有最大光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质浓度 成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白的含量，1 小时内 即可完成蛋白定量检测。本试剂盒含有牛血清白蛋白（BSA） 溶液作为蛋白质标准溶液，测定范围为 25～2000 μg/ml。该 试剂盒可用于 20 次试管检测或 200 次 ELISA 板检测。

操作方法
1. 标准品的稀释：按下表将 BSA 进行稀释。
管号 PBS
BSA 体积
（来源）
BSA 终浓度
（μg/ml）
A 0 300 μl (母液) 2000
B 125 μl 375 μl (母液) 1500
C 325 μl 325 μl (母液) 1000
D 175 μl 175 μl (B 管) 750
E 325 μl 325 μl (C 管) 500
F 325 μl 325 μl (E 管) 250
G 325 μl 325 μl (F 管) 125
H 400 μl 100 μl (G 管) 25
I 400 μl 0 0
2. BCA 工作液的配置：根据样品数量及测定方法，将 BCA Reagent A 和 BCA Reagent B 按体积比 50:1充分混匀即可。
注意：配制 BCA 工作液前请将 BCA Reagent A 混匀。
3. 标准比色杯测定方法
(1)吸取 0.1 ml 的各标准品和待测样品置于合适的管中。
(2)加入 2 ml BCA 工作液，充分混匀。
(3)37℃孵育 30 min，然后室温静置 10 min。
(4)紫外分光光度计于 562 nm 处检测吸光度。
(5)绘制标准曲线。
(6)根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
4. 微管测定方法
(1)分别取 25 μl 新鲜配制的 BSA 标准液和待测样品，加入到 ELISA 反应板中。
(2)每孔加入 200 μl BCA 工作液，充分混匀。
(3)37℃孵育 30 min，然后室温静置 10 min。
(4)酶标仪于 562nm 处检测吸光度。
(5)绘制标准曲线。
(6)根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
注意事项
1. 待测样品浓度在 25~2000 μg/ml 的范围内具有良好的线性关系。
2. BCA 工作液配制后 24 小时内使用效果稳定。
3. BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
4. 使用普通的分光光度计测定时，需根据比色皿的最小检测体积，适当加大 BCA 工作液的用量，使其不小于最小检测体积，样品和标准品的用量可相应按比例调整。
5. 适用范围

实例操作 按上述操作方法可得到如下标准工作曲线，该线性方程经过 多次绘制，系数均为 0.0001，且 R 2 值均在 0.99~1 之间， 重复性好，在计算蛋白浓度时可直接用该标准工作曲线进行 计算。例如：在 562 nm 处检测吸光值为 0.1，则此时 y 值 为 0.1，代入方程 y=0.0001x 中，可得蛋白浓度为 1000 μg/ml。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。