pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体

描述：pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min 就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产 品适用于 Taq 酶扩增的含“A"尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉抗性筛选标记。 

注意：RTS DH5α 冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2 年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3 个月）。
主要特征
（1）快速连接，仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含
任何酶切位点，便于后续亚克隆（5）平末端和 A 尾产物通用。
注意：引物不能磷酸化。
测序引物
正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
操作步骤
1. PCR 产物的纯化
1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂
盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。
1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。
2. PCR 用量和连接时间
PCR 产物大小 PCR 产物用量 载体用量 摩尔比 连接时间 阳性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 连接反应
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂
成 分 用 量
PCR 产物 0.5~4 μl （用量参考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加无菌水至总体积为 5 μl
轻轻吹打混合均匀后，室温（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。
关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物
的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连
接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效
率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。