His标签纯化树脂（Ni-NTA Resin）

描述：

Ni-NTA Resin 是用于纯化 6×His 标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由 4%交联的 Sepharose 耦连了一种四齿螯合剂 NTA 而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的 6xHis 标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合 Ni2+。6×His 可与 Ni2+螯合，从而使 His 标签蛋白结合在 Ni-NTA 纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低 PH 缓冲液被温和的洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。
主要特征
该纯化介质与 His 标签蛋白具有的亲和力，可达5-20 mg/ml。
可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的 His标签蛋白。
纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达 95％。
Ni-NTA 可再生 4-6 次，重复使用。
组成：50％的悬浮液（20％乙醇），已螯合 Ni2+。
应用
His 标签蛋白的纯化。
蛋白结构与功能研究。
蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之间相互作用的研究。
配体-受体之间相互作用的研究。
储存：4℃保存，可保存 2 年。
操作方法
A. 非变性条件下抽提 His 标签蛋白
1. 样品准备
1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的 pET 载体表达系列，在细胞 OD600=0.5-0.8 时，用 1 mM IPTG 诱导 1-3 小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70°C或立即进行步骤 2 操作。
2) 加入 1/20 细胞生长体积的 NTA-0 Buffer (20 mMTris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1 mM PMSF。
注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。
3) 将细胞悬浮起来，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
4) 加入 10% Triton X-100, 使终浓度为 0.05%，充分混匀，冰上放置 15 分钟。
5) 13,000 转/分(20,000xg 以上)，4°C 离心 15min。取上清，置于冰上备用或-20°C 保存。
2. 层析
1) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用 10 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 将上清样品加至 NTA 层析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 层析用 5 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 洗涤填料，流速控制在 30 ml/h 左右。
4) 再分别用 5 倍 NTA 体积的 NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脱填料，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA 体积。
5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。
6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
3. 溶液配方
NTA-0 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
NTA-20 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,
20 mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer:
20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。