Benzonase 核酸酶

是来自经基因工程改进的核酸内切酶。它能降解所有形式(包括单链，双链，线性和环状)的 DNA 和 RNA 而没有蛋白裂解活性，在广泛条件范围具有很高的特异性。它将核酸消化成3-5 碱基长度（杂交限度以下）的 5’-单磷酸寡核苷酸，从重级蛋白中去除核酸的操作，符合 FDA 关于核酸污染的处理规程。Benzonase 核酸酶迅速水解核酸的能力使该酶成为降低粘度以减少处理时间和增加蛋白产量的选择。该酶与BacReady-Protein Extraction Solution和RIPA LysisBuffer 等蛋白抽提试剂配合使用，从而消除粗提物中的核酸，降低粘度。

单位定义：在 30 分钟内使△A260 值降低 1.0(相当于消化 37 μg DNA )的酶量定义为一个活性单位。
应用
蛋白提取时去除核酸污染
2D 凝胶电泳
Western Blot
IP- Western
储存：置于-20°C 保存。
操作方法
1. 组织处理方法：将 30-50mg 动植物组织研磨充分后，加入 100-200 μl RIPA 裂解液，同时加入 1 μlBenzonase 核酸酶，旋涡振荡混合均匀，室温孵育 30min。
2.细胞处理方法：将 106-107悬浮细胞液 6,000 rpm 离心10min 后，弃掉上清液，使用 100 μl RIPA 裂解液重悬细胞，同时加入 1μl Benzonase 核酸酶，旋涡振荡混合均匀，室温孵育 30min。注意：贴壁细胞重悬于 PBS 后，处理方法同悬浮细胞。
3. 大肠杆菌细胞处理：将 500 μl E.coli 培养液 8,000rpm 离心 5min 后，弃掉上清液，使用 100 μl 大肠杆菌裂解液重悬细胞，同时加入 1μl Benzonase 核酸酶，旋涡振荡混合均匀，室温孵育 30min。
4. 裂解步骤完成后，将裂解产物于 13,000 rpm 离心 10min后，取上清即为提取蛋白（包涵体蛋白留取沉淀为提取蛋白）。
5. 提取完蛋白后可利用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。