9N 2.0 DNA连接酶

描述：9N 2.0 DNA 连接酶（又名 9 oN DNA Ligase）能够催 化磷酸二酯键的形成，使与同一互补靶 DNA 链杂交的两条 相邻寡核苷酸链的 5´-磷酸末端和 3´-羟基末端通过磷酸二 酯 键 相 连 。 该 酶 来源于 极 度 耐 热 的 海 底 超 嗜 热 古 菌 （Thermococcus sp.）9°N 菌株中克隆的连接酶基因，在 45℃-90℃ 范围内均有活性。该酶进一步经基因工程基因突 变，使得耐受更高的温度，在 90℃孵育 15min 仍然保留 50% 以上的活性，因此其适用于：（1）高温条件下，连接 DNA 链上的切刻位点；（2）与 PCR 反应条件兼容可用连接酶检 测反应；（2）连接酶链式反应，对等位基因进行特异性检测。 
组分

储存：-20℃可保存 2 年。
活性定义：1 单位指 50μl 反应体系中，45℃ 条件下，15 分
钟内能使 50% 的 1μg 经 BstEII 消化的 λDNA 片段（12
bp 粘性末端）发生连接所需要的酶量。
1X 9N DNA 连接酶反应缓冲液
10 mM Tris-HCl，600μM ATP，2.5 mM MgCl2，2.5 mM
DTT，0.1% Triton X-100（pH 7.5 @ 25℃），45℃ 温育。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。