RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表达感受态

描述：BL21(DE3) Chaprone 感受态细胞中含有分子伴侣蛋 白质粒，其表达产物可协助重组蛋白正确折叠形成可溶活性 蛋白。分子伴侣蛋白质粒为抗性（chloramphenicol， Cmr）的表达受控于四环素（tetR）操纵子，因此该感受态 不适用于抗性表达质粒的转化。 本品使用  的化学感受态技术制备， 其室温可保存 3 天、-20°C 可保存 2 年（推荐保存温度）、 -80°C 可长期保存性能无下降。运输过程中无需干冰，可常 规冰袋运输（推荐运输温度）。该感受态细胞为热激感受态 细胞，转用于蛋白表达（不可用于克隆和载体构建），经 42°C 热激 1min 可获得 105～106 cfu/μg 效价，可满足质粒转化要 求。该制品使用简单、运输、储存方便。

组分
RTS BL21(DE3)Chaprone Competent Cell（10T） 1 瓶
Nano E.coli Transfection Reagent 1 mL
储存：RTS 系列感受态为干粉形式，均可室温保存 3 天，长期保存-20°C（2 年）。经 Nano E.coli Transfection Reagent溶解后的感受态必须分装后，并于-60°C 以下保存。溶解后的感受态细胞避免反复冻融，在-60°C 以下可保存 6 个月。
操作方法
1. 从-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支冻干感受态细胞中，并分装到 10 支 1.5ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。
2. 将 10～100 ng 质粒 DNA（不可使用连接产物、不可使用筛选标记质粒）加入到分装的感受态细胞中，轻弹EP 管（或枪头轻轻吹打），置于冰上 15min。
3. 置于 42°C 热激 1 min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。
4. 热激完毕后，向上述感受态细胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培养基，37 °C 振荡（225 rpm）培养60 min。使质粒上抗性标记基因表达，菌体复苏。
5. 取200 μl复苏菌液涂布到含相应抗生素的LB琼脂平板表面。（含相应质粒抗生素和 20 μg/ml ）
6. 将平板置于 37 °C 培养，12~18 小时后可出现菌落。
7. 挑选生长良好的菌落，接入 LB 培养基（含相应质粒抗生素，20 μg/ml），37 ℃剧烈振荡培养过夜。
8. 1/50 比例接入新的 LB 培养基（含相应质粒抗生素，20μg/ml ，0.5 mg/ml L-阿拉伯糖）37 ℃剧烈振荡培养至菌体密度 OD600 约 0.3（约 2h）。
9. 加入终浓度 2 ng/ml 四环素（诱导 chaprone 伴侣蛋白表达），37℃剧烈振荡培养至 OD600 约 0.5（约 2~4h）。
10. 加入适量 IPTG(0.1-1 mM), 15℃振荡培养 24h（培养摇床无法制冷条件下，室温诱导 8～12h）。
11. 4,000 rpm 室温离心 15 min，收集细胞，进行蛋白表达和可溶性表达分析。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。