Virus DNA/RNA cDNA Synthesis Kit

描述：本试剂盒采用稳定高效的反转录预混体系 5×Golden RT MasterMix 进行 RNA 的反转录反应，使用时只需加入模 板、引物和 RNase Free H2O 即可，大大简化了操作过程、 提高了效率、减少了操作过程中的人为误差。具有快速简便、 重复性高、特异性好、灵敏度高和稳定性好的特点。专用于 病毒 DNA/RNA 样品的反转录反应。 该预混体系包含点突变致 RNase H 活性缺失的 Golden MLV Reverse Transcriptase 反转录酶、dNTP、反应 Buffer 和 RNase Inhibitor。该试剂盒采用的反转录酶去除了 RNase H 活性，从而避免反转录过程中降解 RNA。同时经过突变文 库筛选，使得其热稳定性更强，可耐受 55℃高温反应。相比 于低温条件下反转录反应，采用高温反转录可显著打开 RNA 二级结构，从而提高复杂 RNA 模板的扩增性能、提高反转 录 cDNA 的长度和产量，从而提高后续检测的灵敏度。合成 的链 cDNA 可广泛用于 2nd Strand 的合成、杂交、PCR 扩增、Real-Time PCR 反应等。

组分

储存：请置于-20°C，可保存 3 年；避免反复冻融。
注：如 5×Golden RT MasterMix 出现沉淀属正常现象，可用手捂化，混合均匀后使用不影响实验结果。一步法 cDOn
1. 按以下组分配制反转录反应液
病毒 DNA/RNA 样品 2~10μl
5×Golden RT MasterMix 4μl
*20×Random Primer 1μl
Rnase Free H2O Up to 20μl
*注：反转录引物可根据需要改用特异性引物。
2.根据实际情况反转录可选择快速程序或标准程序
快速程序
37°C 15~30min（cDNA 合成）
85°C 5min（失活 MLV）
标准程序
25°C 10min（引物配对）
55°C 30~60min（cDNA 合成）
85°C 5min（失活 MLV）
注：通常在定量 PCR 实验中使用快速程序进行反转录（反转录效率>80%），在进行高 GC 含量、含复杂二级结构、长片段的模板转录时采用标准程序。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。