5min RNA纯化试剂盒

描述：RNA 纯化试剂盒的优点为迅速仅需 5min 即可完成操作，回收率可高达 70～95％。该试剂盒采用 高特异吸附能力的硅胶吸附柱，应用优化好的特定缓冲 液，可选择性地结合回收目标 RNA，并去除杂蛋白、盐 等。该试剂盒每次可纯化得到高达 50 μg 的 RNA 片段 (>15nt)，回收的产物可直接用于 RT-PCR、用于 NGS 的 RNA 文库制备、基因编辑、显微注射、RNA 标记、转染 等。

 组分

自备试剂：75%乙醇。
储存：室温保存，有效期 2 年。
操作方法
1. 向 50 µl 待回收样品中加入 100 µl RNA CleanupBinding Buffer 用枪头吹打混合均匀。
注意：若样品不足 50 µl 需加入 RNase Free H2O 补至 50 µl；若样品大于 50 µl 则可按比例缩放缓冲液体积，当样品大于 150 µl 时应上两根吸附柱。
2. 向上述溶液中加入预冷 150 µl 无水乙醇（等体积），枪头吹打混合均匀。（当 15nt<RNA<25nt 时可加入 2倍体积的无水乙醇）。
3. 将上述溶液共 300 µl 加入到吸附柱中，室温静置 30s。4℃ 13,000rpm 离心 30s，弃去过柱液。
4. 向吸附柱中加入预冷的 700 µl 75%乙醇，4℃13,000rpm 30s，弃去过柱液，重复此步骤一次。
5. 13,000rpm 空离 2min 后，将吸附柱转移至新的 1.5ml收集管中，室温放置 2min 使残留乙醇挥发。
6. 向吸附柱芯中加入 50~100 µl RNase Free H2O，室温静置 1min 后，4℃ 13,000rpm 离心 2min，获得的产物即为纯化的 RNA。可立即使用或于-80℃保存。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。