血清血浆microRNA提取试剂盒

描述：血清血浆 miRNA 提取试剂盒是目前提取小 RNA（<200nt）操作步骤简单、重复性、小 RNA 产 率的方法之一。使用该试剂盒通过一步上柱即可获得高 纯度 miRNA，可在 10min 左右完成小 RNA 的提取；且使用 该试剂盒提取的小 RNA（Small RNA）中，长度在 15～200nt 范围的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA，可 直接用于后续的反转录、Northern 杂交、测序等应用。

储存：室温可保存 2 年。
使用防护建议：Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍盐，其具有强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就医。
自备试剂：异丙醇、乙醇、75%异丙醇、2ml EP 管
操作方法：
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 800μl Serum/Plasma miRNAReagent。将 300μl 血清或血浆样本加入到上述 800μlmiRNA Reagent A 中，用腕力混匀 30s,室温放置 5min。
(2) 13,000rpm 离心5min，将上清约 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 异丙醇，上下颠倒混合均匀。
(3) 将上述溶液分三次加至吸附柱中（每次约 700μl），13,000rpm 离心 15s，倒掉过柱液。
(4) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000rpm离心 15s，倒掉过滤液。
(5) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000rpm离心 15s，倒掉过滤液。
(6) 吸附柱 13,000rpm 空离心 2min，去掉残留的乙醇。
(7) 将吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室温放置 2min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入 30μl RnaseFree H2O，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物即为提取的 miRNA。
常见问题汇总：
(1) 由于血清血浆中的 miRNA 含量极低，提取的 miRNA 浓度通常在 5 ng/μl 以下，因此难以用常规的 NanoDrop 测量浓度，建议直接使用 10 μl 进行下游反转录。由于本试剂盒提取的是小 RNA，该浓度下的 miRNA Copy 数足以进行下游检测。
(2) 由于血清血浆中 miRNA 的含量低，为了获得更可靠的实验数据，建议使用特异性和灵敏度更好的 TaqMan 探针法进行 miRNA 的下游检测。本试剂盒提取的 miRNA 并不限于其它检测方法和用途，包括 SYBR Green 法检测、二代测序、芯片等检测领域。
(3) 血清血浆 TaqMan miRNA 反转录试剂盒为血清血浆专用，不可用于细胞和组织的 miRNA 检测实验。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。