HG TaqMan miRNA反转录试剂盒

描述： TaqMan miRNA 反转录试剂盒采用加 A 法进行反转录，加 A 法的反转录效率远高于茎环法，因 此，采用该方法可极大的提高检测灵敏度（原理见图 1）。 该试剂盒操作简单，仅需要两步即可轻松完成 miRNA 的 cDNA 合成，合成的 cDNA 可用于所有 miRNA 的后续定 量检测。反转录完毕后采用特异性的上游引物和接头引物 进行 PCR 扩增，FAM 标记 TaqMan 探针作为荧光报告基 团进行定量检测（原理见图 1）。  TaqMan miRNA 反转录试剂盒专用于 miRNAs 分子的反转录试验，转录获得的 cDNA 产物用于 TaqMan 定量 PCR 方法检测 miRNAs 分子

储存：请置于-20°C，可保存 2 年；避免反复冻融
操作方法
1 按以下组分在 0.2 ml EP 管中配制应液
miRNA （5～100 ng/μl） 4 μl
5×TaqMan miRNA RT Solution A 1 μl
注意：不建议使用 Total RNA，Total RNA 试验结果通常差
于 miRNA。
2 在 PCR 仪上按以下条件进行加 A 反应:
 37°C 30min
 85°C 5min
3 反应完毕后，在上述 5μl 反应体系中加入如下试剂，并
混合均匀。
10×TaqMan miRNA RT Primer 2 μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 2 μl
H2O 11 μl
4 在 PCR 仪上按以下条件进行反转录反应:
 30°C 5min
55°C 60min
 95°C 5min
获得的 cDNA 产物可用于多个目标 miRNA 的检测。反转录完毕后获得的 miRNA cDNA，可加入 20~80μl ddH20 稀释2~5 倍，通常取 2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 定量 PCR试剂盒检测。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。