血清血浆TaqMan miRNA反转录试剂盒

血清血浆 TaqMan miRNA 反转录试剂盒采用加 A 法进行反转录，加 A 法的反转录效率远高于茎环法，因此，采用该方法可极大的提高检测灵敏度（原理见图 1）。该试剂盒操作简单，仅需要两步即可轻松完成miRNA 的 cDNA 合成，合成的 cDNA 可用于所有 miRNA的后续定量检测。反转录完毕后采用特异性的上游引物和接头引物进行 PCR 扩增，FAM 标记 TaqMan 探针作为荧光报告基团进行定量检测（原理见图 1）。 的血清血浆 TaqMan miRNA 反转录试剂盒专用于血清血浆 miRNAs 分子的反转录试验（不可用于组织和细胞），转录获得的 cDNA 产物用于 TaqMan 定量 PCR 方法检测 miRNAs 分子（仅适用 TaqMan miRNA 定量 PCR 试剂盒，。

储存：请置于-20°C，可保存 2 年；避免反复冻融
操作方法
1 按以下组分在 0.2 ml EP 管中配制应液血清血浆 miRNA 10 μl5×TaqMan miRNA RT Solution A 2.5 μl
2 在 PCR 仪上按以下条件进行加 A 反应:37°C 30min　85°C 5min
3 反应完毕后，在上述 12.5μl 反应体系中加入如下试剂，并混合均匀。
10×PS TaqMan miRNA RT Primer 2.5 μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 2.5 μl
H2O 7.5 μl
4 在 PCR 仪上按以下条件进行反转录反应30°C 5min　55°C 60mi　95°C 5min获得的 cDNA 产物可用于多个目标 miRNA 的检测。通常取2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 定量 PCR 试剂盒检测该试剂盒有一万余种，详细列表可查询HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls)。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。