TRIzol Reagent

是一种可提取动植物样品中RNA 的制品。样品在 TRIzol Reagent 中能够充分被裂解，在样品匀浆或裂解过程中，它可保持 RNA 的完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。TRIzol Reagent 具有很强的广谱性，可以适用于各种样品的总 RNA 提取，提取过程方便快速，整个操作在一小时内便可以完成。该试剂可用于小量样品（50-100 mg 组织、1x106 细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107 细胞）。对人、动物、植物组织、细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA蛋白质和 DNA污染极低，可用于NorthernBlot、反转录、ployA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和基因克隆。
储存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。
注意：该试剂含有强变性剂，请勿直接于皮肤接触或吞咽，若接触到皮肤或眼睛请尽快到医院处理。实验时务必穿实验服，戴手套。
操作方法
自备试剂：氯仿，异丙醇，70％乙醇（DEPC 水配置），RnaseFree H2O。
Ⅰ 实验前准备：RNA 制备的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
注意事项：
1. 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前用0.1%DEPC 水溶液在 37℃处理 12h，然后在 120℃高压灭30min 以除去残留的 DEPC。
2. 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60min）或使用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用 RNA 实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC处理后再进行高温高压灭菌。
3. RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。