Hi T7 RNA Polymerase

描述：Hi T7 RNA Polymerase 对 T7 噬菌体启动子具有高 度的特异性，并可以其作为启动子，DNA 作为模板体外 合成正义链。双链线性质粒 DNA、PCR 产物均可作为该 酶的底物模板。 Hi T7 RNA 聚合酶经电子重构架及库筛选，与 Wild 型比较来看，酶的 DNA 模板结合区域亲和力更高，使其 具有持续合成能力，从而获得更高的产量，并易于长片段 RNA 的合成。该酶为重组纯化制品，无 DNase 和 RNase 污染。

活性定义：在标准反应体系下，37℃ 1 小时内将 1 nmol的 ATP 掺入酸不溶物所需要的酶量定义为一个活性单位。
储存：置于-20°C 可保存 2 年，如有白色沉淀析出，37°C温浴 5min 后使用，不影响性能。
热失活：75°C，10min。
操作方法
1.配制反应体系
10XHi T7 TransBuffer 2 μl
rNTP Mixture (25 mM each) 3.2 μl
Linearized template DNA 0.5-1 μg
RNase Inhibitor （40U/μl） 0.5 μl
Hi T7 RNA Polymerase (100 U/μl) 0.5-1 μl
DEPC-treated Water up to 20 μl
2. 37℃孵育 2-3h (通常 3h，即可获得>80 μg 的总产量)。
3. 反应完毕后，如需去除模板 DNA，加入 Dnase I（2U）37℃处理 15min。
4. 终止反应：75℃加热 10min，或加入 2 μl 0.5M 的 EDTA(pH8.0)。
注意事项
1.质粒DNA的质量影响RNA的量和完整性。质粒DNA的浓度越高，生成RNA的质量越高，质粒模板DNA应该无RNase污染.
2.该酶为高产酶，RNA 产量高，在反应完毕后，通常存在肉眼可见的浑浊状态，其为反应副产物焦磷酸镁，此时表明反应剧烈。在下一步 RNA 纯化前，可通过短暂离心去除沉淀物，此过程并不丢失 RNA。
3. 通常转录后 RNA 产物浓度在 2-4 μg/μl，因此电泳时，仅需取 0.05-0.1 μl 即可。
4. 关于 T7 启动子序列：（G/C）标示 G 或 C 碱基均可。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。