5min极速病毒RNA提取试剂盒

本试剂盒采用裂解液，可快速可靠的从病毒液样本中纯化出高纯度的总 RNA。该试剂盒是目前国际上操作步骤最少、用时最短的病毒 RNA 提取试剂盒（仅需要 5 分钟）。应用本试剂盒提取的 RNA 可直接用于反转录、基因克隆、定量 PCR 检测等多种分子生物学实验。
注意事项：
(1) 本试剂盒中的 Washing Buffer 中已经加乙醇，无需单独添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蚀性，注意防护。
操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中处理）
液体样本：血清、血浆、唾液、痰液、尿液、细胞培养病毒上清液等液体样本直接吸取 150 μl 到 1.5ml EP 管中，并加入 120 μl RNALB1，漩涡混合均匀 10 秒。打开 1.5ml EP 管盖，并加入 500 μl RNABB2 中，漩涡混合均匀 10 秒。倒入吸附柱中，13000 rpm 离心 30秒，倒掉过柱后的废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
抗凝全血：直接吸取 150 μl 到 1.5 ml EP 管中，并加入 120 μl RNA
LB1，漩涡混合均匀 10 秒。打开 1.5 ml EP 管盖，并加入 500 μl RNA
BB2 中，漩涡混合均匀 10 秒。13000 rpm 离心 30 秒后，将上清液倒入吸附柱中，13000 rpm 离心 30 秒，倒掉过柱后的废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
固体样本：组织、粪便等样本。取 10~100 mg 固体材料样本，加入到 300 μl RNA LB1 中（1.5ml EP 管），并加入几粒钢珠（一般3~4 粒），置于组织研磨仪中，研磨 1 分钟。研磨完毕后，打开管
盖，向匀浆液中加入 750 μl RNA BB2，并 13000 rpm 离心 1 分钟。
打开管盖，用 1 ml 吸头吸取 750 μl 上清液到吸附柱中。13000 rpm离心 30 秒，倒掉过柱废液，进行后续洗涤/洗脱步骤。
（2） 洗涤和洗脱
上述裂解/上柱操作完毕后，向吸附柱中加入 500 μl WashingBuffer，13000 rpm 离心 15 秒，并倒掉过柱废液。重复此洗涤步骤一次。 将吸附柱重新放回离心机，13000 rpm 空离心 1min，将残留的乙醇甩干。 将吸附柱芯放入到 1.5 mL Nuclease Free收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室温放置1 min，13,000rpm离心 1min，洗脱液即为提取的病毒RNA，冷冻保存。
特别说明：
（1）RNA LB1 和 RNA BB2 含有高盐，在样本加入到此溶液后，病毒会迅速灭活。同时此溶液对皮肤有腐蚀性，务必做好防护，如接触到皮肤，用大量清水冲洗。
（2）样本处理过程中的吸头等材料可能含病毒分子，实验完毕后务必妥善处理，不能随意丢弃。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。