全血/血浆/血清总RNA提取试剂盒

该试剂盒是在 TRIzol LS 的基础上改造而成，主要成分为 TRIzol LS 试剂。利用 TRIzol LS 中的高序盐成分，可使 RNA 结合于硅胶膜上，通过漂洗、洗脱即可获得高纯度RNA。该试剂盒专门用于血液、血浆/血清、病毒液等液体样品，可在最短的时间内获得高纯度的 RNA。获得的总 RNA纯度高，没有 DNA 和蛋白质污染，适用于 RT-PCR、qRT-PCR、芯片分析、Northern Blot 等实验。蓝图
(1) Washing Buffer（已含乙醇）勿需加无水乙醇，请直接使用。
(2) TRIzol LS 含有强变性剂，请勿直接于皮肤接触或吞咽，若接触到皮肤或眼睛请尽快到医院处理。实验时务必穿实验服，戴手套。
储存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。
操作方法
1.取 250 μl 抗凝全血、血浆、血清、病毒液样本（体积不足时，加水至 250 μl），加入至 750 μl TRIzol LS 试剂中，然后立即手腕用力上下颠倒混合均匀，静置 5min；如样本为粪便等固体样品，可用 PBS 重悬样品，并匀浆后，3000 rpm离心 5min，取上清作为病毒液样品，操作同上。
2. 向上述溶液中加入 0.2 ml 氯仿，手腕用力振荡 15s，室温放置 2min。
3. 13000rpm 离心 5min，准确吸取 0.5 ml（吸入过多或过少均影响回收率）无色上清至新的 1.5 ml EP 管中。
4. 向上述 0.5 ml 上清液中加入 0.3ml 异丙醇，手腕轻柔上下颠倒数次，并倒入吸附柱中，13000rpm 离心 15s。
5. 向吸附柱中加入 500 μl Washing Buffer，13000rpm 离心15s；重复此步骤一次。
6. 将吸附柱重新放回离心机，13000rpm 空离心 2min，将残留的乙醇甩干。
7. 将吸附柱芯放入到 1.5 ml Nuclease Free 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室温放置 2min,13000rpm 离心 1min，洗脱液即为 RNA 产物，冷冻保存。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。