Equi-phi29 DNA Polymerase

描述：Equi-phi29 DNA Polymerase 是 phi29 的改造体，并 经多次纯化分离而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的链置 换、连续合成特性（>70kb）的基础上，提高了滚环扩增的 反应温度，该酶酶可以在 42 度条件下持续的进行 DNA 合成 （而 phi29 DNA 聚合酶在此温度下反应活性很低）。 这种高温的反应特性，在以下几个方面对实验有明显的 提升：（1）在 NGS 测序中，其提升了高 GC 含量、回文结 构等复杂模板的延伸能力，使得 NGS 的覆盖度更均一，降 低测序所需深度；（2）高温的反应条件，提升了基因组 DNA 的 WGA 产物的合成量，并可以进行变温扩增；（3）降低测 序中 Gap 区域，提升单细胞测序的数据质量和完整度；（4） 降低非特异性扩增产物；（5）提升 MDA/RCA 等实验的扩增 性能和特异性。 除此外，该酶仍然具有很强的 3’→5’外切酶校读功能， 合成的 DNA 片段保真性高。该酶的外切酶活性较强，因此 合成过程中引物需要 3’端硫代修饰，以降低外切活性对引物 的切割效应。

储存：-20℃可保存 3 年。
使用方法
1. 配制引物模板退火体系
10×phi29 Buffer 2 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 1.2 μl
Template DNA 0.1-40 ng
硫代修饰的Oligo x μl
ddH2O Upto 19 μl
注意：在不同的实验类型中，Oligo根据实验需要自行选择。
2. 引物和模板退火：体系配制完毕后，放置到 PCR 仪中，95℃ 3min，25℃ 3min。
3. 退火完毕后，向退火产物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase，混合均匀。
4. 扩增反应
4.1 恒温扩增
对于环状DNA模板采用恒温反应作为推荐使用30℃恒温扩增，30℃孵育 6~16h.该酶在 30-42℃条件下均可工作，必要时根据实验类型进行调整。
4.2 变温扩增
对于基因组 DNA 或 cDNA 模板，推荐使用变温扩增反应，以在短时间内获得更高产量，并提高了低浓度模板的扩增产量。在 PCR 仪上做如下设置：
【30℃ 5min；42℃ 15s】循环 72 次（约 6h）或 120次（约 10h）.必要时，反应结束后，可于 65°C 10min 进行失活反应。
使用注意事项
（1）必要时可单独额外添加终浓度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA，可提高反应效率。
（2）该酶的反应温度为 42 ℃ （在 30~42℃之间均有活性）。
（3）65℃ 10min 即可使该酶失活。
（4）根据实验类型需要，调整dNTP的浓度100~500 μM。
（5）添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 产量。
（6）反应引物 3’端的硫代修饰可避免引物降解。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。