Klenow Fragment(exo-)

描述：Klenow 片段（3´→5´ exo-）是 DNA 聚合酶 I 的 N 末端截短物，它保留了 DNA 聚合酶活性，但失去了 5´→3´ 核酸外切酶活性。该酶进一步经突变（D355A，E357A）去 除了其 3´→5´的核酸外切酶活性。因此该 DNA 聚合酶无任 何外切酶活性，仅包含了 DNA 聚合酶活性，广泛用于标记 探针制备、cDNA 第二条链的合成等建库试验。

单位定义
一个活力单位即在 37°C 条件下，30 分钟内催化 10 nmoldNTP 的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。该酶保存液中含有 50%甘油。
10×Klenow Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25 °C), 50mM MgCl2, 10 mM DTT. 该酶兼容 PCR Buffer 和内切酶Buffer。
应用：
（1）用随机引物制备探针
（2）随机引物法标记
（3）cDNA 第二条链的合成
（4）该酶不能用于产物平端不齐失活：75°C，20min 失活。
储存：-20℃可保存 3 年。
1. 按以下组分配制反应液
10×Klenow Buffer 5 μl
模板 DNA 0.1~2 μg
dATP dCTP dGTP (2 mM each) 0.5 μl
Biotin-dUTP or dATP(2 mM) 0.5 μl
random hexamer(125 μM) 10 μl
ddH2O Up to 50 ul
95°C 5min 冰上放置 5min。
2. 聚合反应
加入 0.5 μl Klenow Fragment(exo-)，混合均匀。37°C 反应 15min，75°C 20min 失活。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。