RAPA3G Probe qPCR MasterMix(with UDG)

描述：RAPA3G Probe qPCR MasterMix 将热启动 RAPA3GDNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP 染料等试剂预混在一起，是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有 ROX 校正染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量 PCR机型。优化的反应缓冲液，使得该制品可用于单重及多重的探针法定量 PCR。制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶，其具有高的杂质耐受性，其对乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多糖多酚具有的耐受性，因此可用于粗样品的直接定量 PCR 检测(Direct PCR)。该酶经化学法修饰，在 50℃以下 无活性，只有 95 度条件下加热 5min 后才能恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增，极大的提高了 PCR 扩增特异性。由于 RAPA3G DNA 聚合酶对 dUTP 具有的识别能力，该制品中的 dTTP 核酸碱基被 dUTP 所取代，因此扩增产物均包含 dUTP，在配合热敏 UDG（该酶在 95℃热变性 5min 后不可逆失活，不影响后续 PCR 反应）的条件下能达到佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的测试条件下，Ct 推迟 15 个以上（污染去除能力>99.997%）。
储存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 个月。如出现白色沉淀溶解后使用，不影响反应性能。该试剂经 30 次冻融后性能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光保存。
RAPA3G DNA 聚合酶对抑制物耐受性
SDS 0.01% Serum 2%
EtOH 5% Plasma Citrate 2%
Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%
Hematin 30μM Trizol 0.5%
操作方法
1、按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系：
终浓度
2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×
Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM
其它引物和探针 X
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
60℃ 30 s 收集信号 退火/延伸
注意：退火延伸温度可在 55-65℃调整
3. 在多数情况下，采用两步法程序可获得理想的扩增效果，在无法达到预期理想效果的情况下，也可采用三步法 PCR程序，程序如下：
Stage 1 25℃ 2 min 去污染
Stage 2 95℃ 5 min 热启动
Stage 3
40 循环
95℃ 5 s 变性
55℃ 10 s 退火
72℃ 30 s 收集信号 延伸
4. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线和标准曲线。
注意：消化污染步骤中的温度设置可在 25-37℃之间均可，无显著差异，但高于 42℃以上的温度会导致热敏 UDG 消化能力急剧下降。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。