2XRAPA HiFi PCR Mix

RAPA HiFi DNA 聚合酶，其来源于高保真 DNA 聚合 酶，并加入了增强的延伸结构，使其具有超保真性能（~280 倍 Taq）、长片段扩增能力、高产量。长片段扩增能力，使用 该酶可轻松扩增 8kb 的基因组 DNA、20kb 的λDNA、8kb 的 cDNA。该酶具有 6kb/min 以上的延伸速度。该 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、强 3’-5’的外切酶活性，产物为平末 端。

特点和用途
(1) 超保真扩增：~280 倍 Taq 的保真性能，是载体构建、点突变、NGS 模板扩增、基因合成的用酶。
(2) 快速扩增：具有 6kb/min 的扩增能力。
(3) 长片段扩增：质粒、λDNA 等简单模板可以有效扩增>20 kb，基因组可以有效扩增>8 kb，cDNA 可以有效扩增>8kb。
储存：长期储存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 个月）保存。
使用方法
1. 按下表配制反应体系并混合均匀：
2×RAPA HiFi PCR Mix 12.5 μl
上游引物(10 μM) 1 μl
下游引物(10 μM) 1 μl
模板 DNA 1-250 ng
ddH2O up to 25 μl
*模板 DNA 用量参数(25 μl 反应体系)
5-250 ng Genomic DNA
0.1-10 ng Plasmid DNA
1-2 μl cDNA from RT reaction
2. PCR 扩增循环参数
（1）扩增片段<5kb 时采用如下程序
循环数 温度 时间
1
st Cycle 95°C 1min
25-35 Cycles
95°C 30s
50~60°C 30s
72°C 6kb/min
Last Cycle 72°C 2min
（2）扩增片段>5kb 时采用如下程序
循环数 温度 时间
1st Cycle 92°C 1min
25-35 Cycles
92°C 10s
50~60°C 30s
72°C 2-3kb/min
Last Cycle 72°C 2min
3. 电泳：1% 琼脂糖凝胶电泳，上样 5 μl，电泳结束在紫外灯下检测条带。
4. 注意事项：（1）当模板 GC 含量>65%时，请添加5× Q-Solution（Cat. No.: A3002）。（2）当扩增片段<1kb>5kb 时，按照2-3kb/min 的延伸时间进行设置，能获得更高的产量。（3）由于不同的 PCR 管其导热性能有所不同，通常 PCR 采用25μl 体系可以获得更高的产量。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。