LAMP Loop DP-Probe (订制品)

该 DP-Probe(DisPlaceable Probe)为链置换荧光探针，专用于LAMP 的荧光扩增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 试剂时表现出极为出色的特异性，可以大幅降低非特异性扩增。LoopDP-Probe Pair 是将 Loop 引物进行改造（LF/B 任意一条均可），其由两条标记引物退火组成：荧光猝灭引物（5’IBFQ+Tail+Loop）和荧光报告引物（Tail 互补区+3’发光基团），其不发荧光。在 LAMP反应中 Loop 引物渗入到“哑铃"结构，由扩增返回“哑铃"延伸并置换游离的荧光报告引物，累积产生荧光信号。有经验的研究人员可根据参考文献自行制备 LAMP Loop DP-Probe Pair，经验不足的人员可委托  来制备， 提供三种荧光标记的探针。需要客户提供 Loop 序列，并指明需要的荧光标记（FAM/JOE/ROX）

eLAMP DP-Probe 试剂的开发简述
1. 引物的粗筛选
无论是变色、试纸条、荧光法 eLAMP 试剂的开发，前期的测试过程， 推荐采用价格较低的液体 HotStart Bst4.2 SYBR Green试剂（进行粗筛选。通常筛选的引物为 3-5 组。10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.测试样品：10e3、100、25、10Copies/管，NTC(16-32 重复)
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到总体积 25 μl置于 70°C 反应 45min，1min 收集一次荧光信号。

良好的引物组具有 以 下 特 性 (Ct) ：

10e3copies =5-10min; 25copies<15min;10Copies<20min, ntc="">40min. 以上实验需要反复确认，以确
保核心引物的工作效率，否则重新筛选，再进行后续的其它测试。
2. Loop DP-Probe Pair 的制备
根据上述引物组的筛选情况，选取引物组。在此基础上改造LF 或 LB，改造哪一条效果更佳，必须经过测试。下面以改造 LF为例进行说明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair（或自行制备）。

注意：

（1）测试试剂更改为 HotStart Bst4.2 Basic 试剂。

（2）10xeLAMP Mix 引物浓度有调整。
10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM；LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到总体积 25 μl
置于 70°C 反应 45min，1min 收集一次荧光信号（注意根据探针荧光标记，选取正确的荧光通道）。与 SYBR Green 结果相比来看，时间会滞后 1-3min。NTC 的控制会明显提升。

此时可进一步做后续的其它项目测试。
3. 如有试剂冻干制备的需求可采用如下几种方案：
（1）(液体试剂)+PrimerMix 自行冻干（专业人员使用）。
（2）PrimerMix+(引物冻干剂)自行冻干，加入 (冻干球)。
（3）（HotStart Bst4.2），全程自行冻干（专业人员使用）。
（4）委托  进行全体系冻干。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。