Bst 4.0冻干Buffer(含冻干赋形剂)

本品为 Bst3.0、4.0 DNA/RNA 聚合酶的专用冻干buffer 系统，为 2.5 倍浓度，包含了反应缓冲盐、Mg2+、冻干赋形剂，在配制体系时加入 dNTP、Bst4.0DNA/RNA 聚合酶后，直接进行冻干反应。无需再进行冻干保护剂的条件优化工作。

储存：-20℃保存 2 年；短期使用放置于 2-8℃，保存 3个月。反复冻融 10 次，不影响使用。如有白色沉淀，于37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀，不影响使用。该 Buffer中含有 15 mM Mg2+，必要时可自行调整。
注意：本试剂仅适用于  生产的无甘油系列 Bst 3.0、4.0.
使用方法：
1. 配制冻干体系
2.5xBst4.0 Lyo Buffer 10 μl10 mM each dNTP 2.5 μlBst4.0 Glycerol Free(32U/ul) 0.2-0.5 μl12.5xLAMP Primer Mix 2 μlddH2O到总体积 15 μl
注意：（1）该混合物 15 μl 加入到 0.2ml EP 管后上机冻干。该反应体系设计为 25 μl 的终反应体系，冻干体积为15 μl。
（2） 12.5xLAMP Primer Mix 的配制，FIP/BIP 分别为20 μM、LoopF/B 分别为 5 μM、F3/B3 分别为 2.5 μM。2. 反应体系冻干完毕后冻干品中加入检测模板和 ddH20（总体积25 μl）即可进行 LAMP 等恒温扩增。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。