T4 DNA Ligase（T4连接酶）

浓    度： 5U/μl
产品概述：
在有Mg2+和ATP存在的条件下，T4 DNA Ligase能催化双链 DNA或RNA上相邻的5′-磷酸末端和3′-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化双链DNA的平末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻，但不能催化单链 DNA 之间的连接。
保存条件：-20℃保存。
酶储存缓冲液：
10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ，50mM KCl，1mM DTT， 0.1mM EDTA，50% (v/v) glycerol。
5 × T4 DNA Ligase Buffer
250 mMTris-HCl (pH 7.5)， 50mM MgCl2，50mM DTT， 5mM ATP，连接促进剂。
来     源：纯化于携带T4 DNA ligase 基因 的E. coli 菌株。
抑制剂和热失活：
大于200mM的NaCl或KCl可以强烈抑制连接酶活性。65℃加热 10分钟或70℃加热5分钟即可失活。
单位定义：
在37℃，20分钟内交换1 nmole 的32PPi所需要的酶量定义为一个Weiss单位。本产品酶1U(Weiss Unit)相当于200个粘性末端单位。在T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃条件下，30分钟能够使50%的经Hind III消化的λDNA 片段连接所需要的酶量为一个粘性末端单位。
质量控制：
蓝白斑分析实验表明白斑数小于2%;过量T4 DNA Ligase 混合超螺旋质粒检测实验表明无核酸酶检出；SDS-PAGE检测重组蛋白纯度大于99%。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。