pBM28 Toposmart 克隆试剂盒

保存条件：-20℃保存。
产品介绍：
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM28载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5 等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM28 载体类似于公司的pENTR/D-TOPO入门载体， 具有attL1 和attL2，为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。
产品特点：
（1）连接反应仅需 5 分钟。
（2）只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
（3）载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选。
（4）与pBM27载体相比，pBM28载体无标签序列。
（5）载体为壮观霉su抗性。
注意事项：
（1）引物要求：PCR 引物5’端不能进行磷酸化修饰，普通商业化引物即可。上游引物的5’ 端添加CACC 四个碱基（CACC 为真核表达所必需的Kozak 序列）。
（2）DNA 聚合酶：选用Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和Xerox 等高保真DNA 聚合酶用于PCR 扩增。
（3）连接时间：5-15 分钟，一般为 15 分钟。
（4）连接温度：室温 (22℃-37℃)，可使用PCR仪控温。反应温度为25℃。若片段有高GC等复杂结构，可在37℃反应。
（5）产物要求：为保证PCR产物完整，建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。