Bst 3.0 DNA/RNA polymerase

储存条件：-20℃保存
产品简介：
Bst 3.0 DNA/RNA 聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）DNA 聚合酶 I 大片段（Bst LF）经过基因突变改造
过的聚合酶。该酶具有 5’-3’的 DNA 聚合酶活性和链置换活性，无 5’-3’核酸外切酶活性。与 Bst 2.0 DNA/RNA 聚合酶相比，Bst 3.0DNA/RNA 聚合酶的热稳定性、扩增速度、链置换速度和逆转录活性有了进一步的提升。适合高温快速 LAMP 类型的等温扩增实验。
活性单位： 一个活力单位（1 U）即在 65°C 条件下，30 分钟内催化 25 nmol dNTP 的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。
质量控制：SDS-PAGE 检测纯度大于 99%，经检测无核酸外切酶，内切酶活性，无细菌基因组 DNA 残留。通过各种模板进行等温扩增测试。室温存放一周，无明显活性改变。
应用范围：
1.DNA 或 RNA 为模板的 LAMP 等温扩增。
2.适用于链置换方法扩增 DNA。
3.高 GC 结构 DNA 的测序和微量 DNA 模板快速测序。
10×Bst Buffer：200 mM Tris-HCl，100 mM (NH4)2SO4，500 mM KCl，80mM MgSO4，1% Tween® 20
pH 8.8@ 25°C
储存缓冲液：10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol，0.1% Triton
® X-100，pH 7.5 @ 25°C
使用方法：

1. 按以下组分配制 LAMP 等温扩增反应液，建立反应体系。

2. 混匀，离心数秒，置于控温设备中 65℃反应 30-60min。
3. 反应结束后 85℃，5min 失活聚合酶。电泳检测或肉眼观察并记录结果。
注意：
1.Primer Mix(10×)配制方法，用灭菌水将引物全部溶解至浓度为 100µM 的储存液。取一干净离心管，先加 56 μL 灭菌水，然后取FIP 和 BIP 引物各 16 μL, LF 和 LB 各 4 μL，F3/B3 各 2μL，混匀即可。
2.反应体系中可以添加 dUTP 和热敏 UDG 酶。经测试占比 50%的 dUTP（0.7mM）不影响 Bst 酶活性。热敏 UDG 酶用量可按供应商的推荐用量和方法添加。
3.可使用带热盖加热的 PCR 仪以及金属加热块或恒温水浴作为控温设备。无热盖加热装置，需要在反应管中添加一滴石蜡油，防止反应液蒸发。
4.可以在反应体系中添加适当浓度的 SYTO®-9、EvaGreen
® 、SYBR
® Green I 等荧光染料分子，用于实时荧光等温扩增。
5.为防止扩增产物污染造成假阳性结果，在其它房间对阳性样本进行 2%以上浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。

一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成         等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；

五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；

六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。

七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。

八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；

①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。